熒光定量PCR(qPCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，它將在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
 

　　熒光定量PCR的測定步驟：
 

　　1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
 

　　-儀器檢查：打開設(shè)備電源，檢查是否正常啟動；查看觸摸屏、電腦連接等是否正常。
 

　　-樣品準(zhǔn)備：確保樣品的質(zhì)量良好，無雜質(zhì)和污染，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)稀釋樣品。
 

　　-引物設(shè)計(jì)：合理設(shè)計(jì)引物序列，確保其特異性和互補(bǔ)性，避免引物間的二聚體或非特異性擴(kuò)增。
 

　　-反應(yīng)體系準(zhǔn)備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備好反應(yīng)體系，包括引物、模板DNA、熒光標(biāo)記的探針和PCR反應(yīng)緩沖液等。
 

　　2.設(shè)置PCR反應(yīng)：
 

　　-選擇適當(dāng)?shù)臒嵫h(huán)參數(shù)：包括初始變性溫度和時(shí)間、退火溫度和時(shí)間以及延伸溫度和時(shí)間。這些參數(shù)應(yīng)根據(jù)具體的引物和模板特性進(jìn)行優(yōu)化。
 

　　-將反應(yīng)體系加入PCR管或板中：并確保密封良好以避免污染和蒸發(fā)。
 

　　-將PCR管或板放入PCR儀中：并關(guān)閉蓋子以確保溫度均勻分布。
 

　　3.開始PCR反應(yīng)：
 

　　-啟動PCR程序：按照設(shè)定的熱循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
 

　　-實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號：在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號強(qiáng)度。
 

　　4.數(shù)據(jù)分析：
 

　　-生成擴(kuò)增曲線：通過將熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)作圖生成擴(kuò)增曲線。
 

　　-確定閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)：Ct值是指擴(kuò)增過程中熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。
 

　　-計(jì)算相對表達(dá)量或絕對拷貝數(shù)：使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或比較\(2^{-\Delta\Delta Ct}\)法等方法對目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析。